[经验心得] 蛋白MD的实验验证讨论 相关搜索: 实验, 验证, 征集

jsbach

homeboy觉得不好就删吧   我的经验很少  大家一起总结用过的八   关键是要又便宜又上来就可以做不复杂的~~~

荧光方面
可以做寿命  和  弛豫  比较便宜  但是一般只能说一个局部的大概变化   
此外如果你的蛋白不稳定  可以找它没有色氨酸荧光的亚基一起做   会好一些
ANS等疏水探针相当好用   可以和可溶剂化面积计算  结合

EPR
很老  但是可以看金属价态

等温滴定量热
测结合能的经典方法

可以用binding assay   还有  pull-down辅助一下



先写这些~~

jsbach

准备之后用的

激光共聚焦散射   测微粒大小   之前看过一个人 用在HSA上面
如果MD发现确实我的蛋白变松散了就可以用了  这个还是很敏感的

实际上测  是二聚体还是单体更好用   样平量少  给出的是分布图

jerry1986

我也来说说，对于二聚体以及寡聚体的检测，个人认为最好的方法是SEC，方便而且证据确凿，色谱图打出来跑不掉。
   对于二级结构，最好、也是最实际的方法是CD，它甚至可以直接计算出二级结构的含量，只是样品量和样品浓度的要求，有点心疼。。。。。。。。
    楼上的提到激光共聚焦，让我想起来了另一种好东东，动态光散射（DLS），它可以很好的得到蛋白质或者聚集体的size，以及不同size蛋白质的分布情况。不过普通的DLS是测不了蛋白体系的，需要加一个滤光片还是什么东西，没做过。。。。。。
    恩，暂时想起来这么多，不过捎带说了哈，我觉得验证MD最好的试验是X-ray，NMR，想想RMSD都能验证出来，啧啧。可惜咱没条件。

eming

binding assay  和 pull-down很实用，而且又不需要什么大的设备，适合我们这样的穷人来做

jsbach

我错了我错了
就是那个   写ps写头晕了  没有共聚焦  疯了。。。。。。
不过CD不费样品啊    现在都是小样品池  几百微升就够了    不需要装满   盖过光径就好   而且蛋白浓度高多少会混浊 反而不好

以前做荧光寿命时我们都有配的小垫抬高样品池  4ml  的装1ml就可以
还有一个窍门    你要判断光路  就把荧光仪的发射波长调成绿光，多少忘了  放白纸到里面  能看到很明显的绿点  抬高多少就有准了
这样我们用popop标样矫正， 发现不影响结果  精度和文献完全一样